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不同尘螨过敏原诱导组胺释放能力分析
作者: 刘婉莹, 向军俭, 刘志刚 主题: 重组尘螨Derf1, Derf2, 肥大细胞, 组胺 年份: 2009
摘要: 目的:研究用肥大细胞组胺体外定向释放模型分析重组尘螨过敏原derf1derf2的致敏差异性。方法:用重组尘螨致敏原derf1derf2免疫c57/bl6小鼠,收集小鼠腹腔致敏肥大细胞(pmc),在96酶标板孔中分别按不同比例混合尘螨致敏组分诱导pmc定向释放组胺,荧光法检测其释放水平。结果:derf1derf2及两者的混合物都能引起pmc释放组胺,其致敏效果derf2明显高于derf1,derf1derf2混合致敏组胺释放量未见高于单组分致敏者。牛奶和虾的粗提液与空白对照不能引起pmc组胺的明显释放。结论:尘螨混合组分未能引起比单独derf1derf2强的组胺释放,两者间不存在协同效应。组胺释放量随derf2比例升高而升高,推测在尘螨过敏中derf2起主要作用。尘螨与牛奶、虾之间不存在交叉反应。
利用套式PCR技术鉴别屋尘螨和粉尘螨主要变应原基因及其在尘螨疫苗研制中的应用
作者: 白羽, 吉坤美, 刘志刚, 包莹, 李盟 主题: 尘螨, Der p1, Der f1, 套式PCR, 疫苗 年份: 2007
摘要: 通过提取屋尘螨和粉尘螨疫苗研制用的原始种子和生产种子基因组dna作模板,分别设计der p1和der f1各2套内外扩增引物并进行一步法套式pcr,根据扩增出目的片段来检测尘螨变应原der p1和der f1基因片段,并以培养基提取物为阴性对照和已通过形态学鉴别为纯屋尘螨、纯粉尘螨的基因组dna为阳性对照。pcr产物经电泳后切胶回收并克隆到t载体上,进行dna序列分析并在genbank中进行同源性比较。结果显示,从屋尘螨和粉尘螨疫苗研制用的原始种子和生产种子分别扩增出含有屋尘螨和粉尘螨主要变应原der p1和der f1基因片段,扩增部分的序列与genbank数据库里相应序列同源性为100%。从阴性对照提取物中未扩增得到目的基因片段,从阳性对照dna提取物中能扩增得到目的变应原der p1和der f1基因片段。本研究首次应用套式pcr技术鉴别了屋尘螨和粉尘螨原始种子和生产种子,为尘螨疫苗研制以及工业化生产提供了一种有效的质量控制手段。
粉尘螨I类变应原基因的多态性分析及表达蛋白的特性鉴定
作者: 白羽, 吉坤美, 刘志刚, 蔡成郁 主题: 粉尘螨, Derf1, 基因多态性, 原核表达 年份: 2007
摘要: 目的克隆表达我国深圳地区粉尘螨i类变应原der f 1基因,并进行该基因的多态性分析和鉴定该纯化蛋白的变应原性,为研究具有我国区域特色的粉尘螨变应原奠定基础。方法从深圳地区挑取经形态鉴定的活粉尘螨,提取总rna,rt-pcr扩增der f 1基因,克隆到t载体测序确认。通过计算机软件进行该基因的多态性分析。将该目的基因克隆到pet-his表达载体上得到重组质粒pet-der f 1。工程菌经iptg诱导培养,表达der f 1目的蛋白。重组der f 1蛋白通过6 his-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化,并进行western-blot检测纯化的der f 1蛋白与粉尘螨过敏病人血清中ige的反应性,以鉴定重组der f 1的变应原性。结果以粉尘螨总rna为模板,经rt-pcr从深圳地区克隆了4株der f 1基因。该基因与genbank公布的der f 1(no.ab034946.1)比较发现核苷酸的同源性在99.48%-100%之间,理论推导的氨基酸序列同源性在99.69%-100%之间。工程菌经iptg诱导后高效表达的der f 1重组蛋白,并主要以包涵体形式存在。western-blot试验证实该4株der f 1基因表达的重组蛋白都具有变应原性。结论本研究克隆了4株深圳地区粉尘螨i类过敏原基因并实现了原核表达,为进一步开展der f 1蛋白研究和重组变应原免疫治疗疫苗研究奠定基础。
空调空气滤网灰尘中尘螨变应原Der f1和Der p1基因的检测
作者: 白羽, 刘志刚, 张红云, 吉坤美, 雷超 主题: 空调, 灰尘, Der f1, Der p1, 基因检测 年份: 2007
摘要: 目的应用pcr技术检测空调空气滤网灰尘中尘螨变应原der f1der p1的基因。方法从深圳和北京地区分别收集20台、10台空调过滤网上的灰尘样品,分别提取其生物总基因组dna作pcr模板,分别设计der f1der p1各两套内外扩增引物分两步进行pcr,通过扩增出目的片段来检测空调空气滤网灰尘中尘螨变应原der f1der p1基因片段,并以深层泥土dna提取物为阴性对照和以培养的粉尘螨、屋尘螨基因组dna提取物为阳性对照。pcr产物经电泳后切胶回收目的片段并克隆到t载体上,进行dna序列分析并与gen bank进行同源性比较分析。结果深圳地区20台空调空气滤网上收集的灰尘中均含有粉尘螨和屋尘螨主要变应原der f1der p1基因片段;北京地区10台空调空气滤网上收集的灰尘样品中,只有4份均含有der f1der p1;它们扩增部分的序列与genbank数据库里相应序列同源性为100%。从阴性对照提取物中未扩增得到目的变应原der f1der p1基因片段,从阳性对照的dna提取物中分别扩增得到目的变应原der f1der p1基因片段。结论本研究首次应用分子生物学技术证实了空调空气滤网上的灰尘中存在尘螨主要变应原der f1der p1基因,并提示深圳地区空调过滤网灰尘中尘螨可能比北京地区的多,从而为今后防治空调中尘螨引起的变态反应性疾病提供了依据。
标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中主要变应原Der f 2含量测定
作者: 吉坤美, 刘晓宇, 唐艳, 詹政科, 刘志刚 主题: 尘螨过敏原, Der f 2, 单克隆抗体, 夹心ELISA 年份: 2010
摘要: 目的研制粉尘螨ⅱ组变应原der f 2单克隆抗体(monoclonal antibody,mcab),并建立双单抗夹心elisa检测方法 ,测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中der f 2的含量。方法应用基因工程方法获得粉尘螨变应原der f2重组蛋白并通过亲和层析纯化,再免疫小鼠,利用间接elisa筛选获得mcab杂交瘤细胞株并纯化、鉴定抗体的特异性;用一株单抗包被酶标板,同时用生物素标记另一株单抗,从而建立双单抗体夹心elisa法;并用此法测定粉尘螨变应原脱敏疫苗中der f2的含量。结果成功地获得了一株单抗3b12与屋尘螨抗原具有交叉反应,另外一株单抗3g7与屋尘螨抗原没有交叉反应,并建立了双单抗夹心elisa方法测定der f2的含量,其方法的检测限为0.5ng/ml,并在6.25ng/ml-300ng/ml范围内线性良好;标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中der f2的含量为100ng/10000bau。结论成功制备了高效价抗der f 2单抗,并建立了双抗体夹心elisa检测方法。该方法具有很高的灵敏度,可以测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中主要变应原der f 2含量,为临床应用奠定基础。
粉尘螨Ⅱ类变应原的克隆表达、纯化及其免疫学特性
作者: 朱健琦, 刘志刚, 高波, 吉坤美, 邢苗 主题: 粉尘螨, 变应原, 表达, 纯化 年份: 2006
摘要: 目的获得大量具有良好的ige结合活性的der fⅱ重组变应原,以促进粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断及治疗的研究。方法挑取经纯培养的粉尘螨,提取总rna,采用rt-pcr的方法扩增der fⅱ片段,产物连接进入t载体(pmd18)。经扩增后,用ndeⅰ和xhoⅰ双酶切后将目的片段连接到pet-24a表达载体上,得到重组质粒pet-der f2,工程菌经iptg诱导培养,明显表达出der fⅱ蛋白,表达产物经固定化金属配体亲和层析纯化,用western blot检测免疫学活性。结果成功提取粉尘螨的总rna,扩增出编码129个氨基酸的长度为387个碱基对的核苷酸片段。序列分析结果和genebank上的基因序列(d10448)同源性98%,其中有6个碱基不同。使用高效表达的原核载体pet,所得产物的5′端含有抗原性极小的6个组氨酸标签。表达质粒在e.colibl21 star中得到高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,目的蛋白具有良好的变应原性。结论成功构建了粉尘螨ⅱ类变应原的原核表达载体,并纯化了具有免疫特性的重组蛋白,为进一步开展der fⅱ蛋白和重组疫苗研究奠定了基础。
粉尘螨Der f18变应原的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定
作者: 朱永烽, 刘志刚, 高波 主题: 粉尘螨, Der f18, 诱导表达, 纯化, 免疫印迹 年份: 2008
摘要: 通过对纯培养的粉尘螨提取总rna,采用rt-pcr方法有效地扩增出der f18片段,将der f18连接到pet-24a表达载体上并转化到表达菌bl21(de3)中,得到重组质粒pet-der f18和重组工程菌。重组工程菌经iptg诱导培养,高效表达出der f18蛋白,sds-page结果显示表达产物约为52kda。表达产物经亲和层析纯化,用western blot方法检测免疫学活性,结果表明目的蛋白具有良好的免疫原性。
粉尘螨Ⅰ类变应原(Der fⅠ)的克隆表达、纯化及免疫学特性
作者: 朱健琦, 刘志刚, 高波, 吉坤美, 邢苗 主题: 粉尘螨, 变应原, 表达, 纯化, 特性鉴定 年份: 2006
摘要: 粉尘螨ⅰ类变应原(der fⅰ)是粉尘螨dermatophagoidesfarinae主要变应原,可引发ⅰ型变态反应。挑取纯培养的粉尘螨,提取总rna,采用rt-pcr方法有效地扩增出derfⅰ片段,产物连接入t载体(pmd18)。经扩增后,用ndeⅰ和xhoⅰ双酶切后将目的片段连接到pet24a表达载体上,得到重组质粒pet24a-derfⅰ,工程菌经iptg诱导培养,高效表达出derfⅰ蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在。表达产物经亲和层析纯化,用westernblot及elisa方法检测免疫学活性,结果表明目的蛋白具有良好的免疫原性。
抗粉尘螨主要变应原Der f1单克隆抗体的制备与鉴定
作者: 顾耀亮, 李佳娜, 陈家杰, 吉坤美, 刘志刚 主题: Der f1, 粉尘螨, 主要变应原, 单克隆抗体, 特性鉴定 年份: 2009
摘要: 目的制备和鉴定鼠抗粉尘螨主要变应原der f1的单克隆抗体(monoclonal antibody,mcab)。方法利用重组der f1蛋白为免疫原,免疫balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤ns-1细胞融合。通过间接elisa法筛选特异性分泌的杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白a亲和层析法进行抗体纯化。采用ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的ig亚型;通过间接elisa、western blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。结果获得6株可稳定分泌鼠抗粉尘螨主要变应原der f1的单克隆抗体,其ig亚型均为igg1,且6株单抗均具有良好的效价。elisa和western-blotting分析表明,该6株单抗均能识别重组der f1蛋白和天然的粉尘螨提取物。其中,除了484不识别屋尘螨提取物,其他均能识别。结论成功制备了6株鼠抗粉尘螨主要变应原der f1的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原der f1检测及纯化方法奠定了基础。
室内空调机滤尘网及空气中浮动尘螨变应原的测定
作者: 练玉银, 刘志刚, 王红玉, 蔡成郁, 刘晓宇 主题: 尘螨, 变应原, 空调, 哮喘, 浮动空气 年份: 2007
摘要: 目的检测开空调机前后室内空气中及空调机滤网灰尘中尘螨主要变应原的浓度,探讨空调机滤网中的尘螨变应原与哮喘发病的关系。方法采集开空调机前后哮喘患者和健康者家庭卧室空气中的灰尘及空调滤网灰尘,分别用elisa检测其粉尘螨1组变应原(derf1)、屋尘螨1组变应原(derp1)和尘螨2组变应原(der2)的浓度。结果哮喘患者家庭空调开机前空气中derp1、derf1der2的浓度分别为(0.23±0.13)、(2.62±1.08)和(0.93±0.41)ng/m3,开机后依次为(0.56±0.25)、(4.74±1.22)和(2.33±0.64)ng/m3,开机前后相比,三者浓度差异均有统计学意义(p<0.05);健康者家庭空调开机前空气中derp1、derf1der2的浓度分别为(0.33±0.11)、(11.5±3.08)和(2.1±0.8)ng/m3,开机后分别为(0.63±0.23)、(19.8±4.3)和(3.6±1.0)ng/m3,开机前后相比,三者浓度差异均有统计学意义(p<0.05)。空调滤网灰尘中derp1、derf1der2的浓度,哮喘患者家庭分别为(0.52±0.19)、(3.34±0.63)和(2.53±0.65)μg/g灰尘,健康者家庭分别为(1.30±0.35)、(5.16±0.92)和(3.47±1.13)μg/g灰尘。空调滤网灰尘中尘螨主要变应原浓度,健康者家庭和哮喘患者家庭的derf1der2浓度均大于使过敏人群致敏的尘螨主要变应原浓度阈值2μg/g灰尘。结论空调滤网灰尘中存在尘螨抗原,是室内尘螨变应原的重要来源之一,是引起过敏性哮喘的诱因之一。

 

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