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平榛主要过敏原Cor h 1的克隆表达、纯化及免疫学鉴定
作者: 莫绪成, 吴序栎, 刘志刚 主题: 平榛, Cor h1, 基因克隆, 表达 年份: 2009
摘要: 目的克隆、表达榛(平榛)主要变应原基因cor h1,检测其免疫学活性。方法提取平榛的总rna,设计带有酶切位点的特异性引物,采用rt-pcr方法扩增目的基因,将其克隆入t载体中进行测序和分析。采用rt-pcr获得整个短的开放阅读框并将目的基因克隆到大肠杆菌表达载体pet28a中进行表达。通过ni2+亲和层析,对重组蛋白进行纯化,采用免疫印迹(western-blot)方法检测其ige结合活性。结果克隆获得了平榛的主要过敏原cor h1的基因,该基因被genbank收录,登陆号为eu195058。基因开放阅读框为486个碱基(包括终止密码子),编码161个氨基酸。该序列编码的蛋白等电点为6.16,相对分子质量约为17600。结论成功地克隆和表达了平榛主要变应原cor h1,蛋白具有良好的免疫原性。
Ca~(2+)离子对榛子过敏原Cor h 1二级结构和抗原活性影响研究
作者: 吴海强, 王晓娟, 邬玉兰, 张昉, 刘志刚 主题: 榛子, rCor h 1, Ca2+结合特性, 圆二色谱, ELISA, 抗原活性 年份: 2012
摘要: 目的:研究ca2+离子对非cabps蛋白类过敏原二级结构和抗原活性的影响。方法:以重组榛子主要过敏原cor h 1为研究对象,用圆二色谱(cd)研究了系列浓度的ca2+和edta各自存在情况下,不同蛋白浓度溶液中rcor h 1二级结构的变化及规律,并以榛子过敏患者血清为一抗,用elisa实验分析了ca2+和edta对rcor h 1抗原活性的影响。结果:在高浓度rcor h 1溶液中ca2+的加入可以引起椭圆率的增加,而在低浓度的rcor h 1溶液中则引起椭圆率的降低;edta在高浓度和低浓度的rcor h 1溶液中均能引起rcor h 1二级结构相对含量的降低;椭圆率增加(或降低)的幅度与ca2+、edta终浓度成正比。elisa实验表明ca2+和edta都能显著降低rcor h 1的抗原活性。结论:ca2+离子可以显著影响rcor h 1的二级结构,降低其抗原活性,为非cabps蛋白类低致敏原的研究奠定了较好的前期研究基础。
花生过敏原Ara h 8的克隆表达、纯化及免疫学鉴定
作者: 易海涛, 刘志刚, 刘芳, 闫浩, 汤慕瑾, 肖小军, 夏立新 主题: 花生, 过敏原, Ara h 8, 克隆表达, 纯化, 免疫印迹 年份: 2011
摘要: 目的:克隆花生主要过敏原ara h 8基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法:提取花生总rna,设计特异性引物,rt-pcr克隆花生ara h 8基因;将反转录的基因连入pmd19-t simple vector,提质粒酶切鉴定并测序。将测序正确的片段连入原核表达载体pet-32a(+)上,并转入bl21(de3)宿主表达菌中;iptg诱导表达;通过ni2+亲和层析(fplc)纯化目的蛋白ara h 8;western blot检测该重组蛋白的免疫原性。结果:测序结果表明克隆的花生ara h 8基因片段全长为474 bp,编码157个氨基酸,与genbank中蛋白序列100%相同。重组蛋白纯化后经sds-page鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。western blot结果表明该蛋白与花生过敏病人混合血清中ige结合,具有免疫原性。结论:成功克隆并表达纯化了花生过敏原ara h 8,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。
经合理的序列重组制备花生主要过敏原Ara h 2低致敏衍生物
作者: 易海涛, 刘芳, 夏立新, 闫浩, 刘飞燕, 李建杰, 刘志刚 主题: 花生, 重组, 过敏原 Ara h 2, 低致敏衍生物, 疫苗 年份: 2011
摘要: 目的:构建经序列重组的ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其低致敏原性。方法:根据已鉴定的ara h 2 ige抗原表位,利用基因工程技术将ara h 2基因进行合理的组合,并将其序列进行合成,再将合成后的基因连入原核表达载体pet-32a(+)上,然后转入origami宿主表达菌中;iptg诱导表达;通过ni2+亲和层析(fplc)纯化目的蛋白;western blotting和elisa鉴定该重组蛋白的低致敏原性。结果:测序结果表明合成后的序列成功转入原核表达载体pet-32a(+)上。重组蛋白纯化后经sds-page鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。western blotting和elisa结果均表明通过基因工程改造的ara h 2蛋白(s-ara h 2)与重组的ara h 2(r-ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏病人混合血清中ige显著降低。结论:成功构建了经序列重组的ara h 2表达载体,该基因表达的重组蛋白具有良好的低致敏原性,这将会为花生过敏患者的脱敏治疗提供了新的安全疫苗基础。
设计和鉴定花生主要过敏原Ara h 2低致敏原衍生物
作者: 易海涛, 刘志刚, 夏立新 主题: 花生, 设计和鉴定, 过敏原, Ara h 2, 低致敏原衍生物 年份: 2011
摘要: 构建序列重新组合的ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其低致敏原性。将ara h 2基因进行合理的缺失和重排,并将重排后的基因t-ara h 2克隆到原核表达载体pet-32a(+)上,然后转入origami宿主表达菌中;再用iptg诱导其表达;通过ni2+亲和层析(fplc)纯化目的蛋白;western-blotting和elisa鉴定该重组蛋白的低致敏原性。测序结果表明重排后的序列成功克隆到原核表达载体pet-32a(+)上。重组蛋白纯化后经sds-page鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。western-blotting和elisa结果均表明:t-ara h 2与重组的ara h 2(r-ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏病人混合血清中ige显著降低。成功构建了基因重排的ara h 2表达载体,该重组蛋白具有良好的低致敏原性。
经基因工程改造的花生主要过敏原Ara h 2制备及其低致敏原性鉴定
作者: 易海涛, 刘芳, 贾梦阳, 汤慕瑾, 曹小勇, 夏立新, 刘志刚 主题: 基因工程, 花生, 过敏原, Arah2, 低致敏 年份: 2011
摘要: 构建经基因工程改造的ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其过敏原性。将花生主要过敏原arah 2基因序列进行颠换,并将颠换后的序列进行合成,再将合成后的基因克隆到原核表达载体pet-32a(+)上,然后转入origami宿主表达菌中;利用isopropylβ-d-1-thiogalactopyranoside(iptg)诱导表达;通过ni2+亲和层析纯化目的蛋白;western blotting和elisa鉴定该重组蛋白的过敏原性。测序结果表明合成后的序列成功整合到原核表达载体pet-32a(+)上。重组的目的蛋白纯化后经sds-page鉴定,蛋白大小与理论值相符。western blotting和elisa结果均表明经基因工程改造的ara h 2(f-ara h 2)蛋白与重组的ara h 2(r-ara h 2)蛋白相比,结合花生过敏患者混合血清中ige显著降低。成功构建经基因工程改造的ara h 2表达载体,初步的体外实验表明该基因表达的重组蛋白具有低致敏原性。
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