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大豆主要过敏原Gly m Bd 30K基因的克隆及其原核表达载体的构建
作者: 邬玉兰, 刘志刚 主题: 大豆, 过敏原, Gly m Bd 30K, 克隆, 原核表达载体 年份: 2009
摘要: 利用rt-pcr克隆大豆主要过敏原gly m bd 30k的全长基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增大豆gly m bd 30k的完整开放阅读框,与pet-28a载体连接,构建原核表达载体。结果表明:克隆了大豆主要过敏原gly m bd 30k基因,且构建了其原核表达载体。该基因含有长度为1 140 bp的开放阅读框,编码379个氨基酸。该蛋白质的相对分子质量为42 758,等电点为5.08。序列同源性分析发现其与数据库中已知的gly m bd30k基因同源性很高,因此认为其是大豆的过敏原基因,在genbank数据库中的登录号为eu883600。克隆的大豆主要过敏原gly m bd 30k基因及构建的原核表达载体,为大豆主要过敏原gly m bd 30k的重组表达和免疫活性鉴定等奠定基础。
大豆主要过敏原Gly m Bd 30K蛋白单克隆抗体的制备与应用
作者: 邹菊, 刘志刚 主题: 大豆主要过敏原Gly m Bd 30K蛋白, 单克隆抗体, 特性鉴定, 双抗体夹心法 年份: 2011
摘要: 利用大豆主要过敏原gly m bd 30k蛋白抗原表位蛋白为免疫原免疫balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤ns-1细胞融合。采用半固体培养基法和有限稀释法相结合的方法快速筛选获得稳定分泌的特异性杂交瘤细胞,用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白a亲和层析法进行抗体纯化。采用ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的ig亚型;通过间接elisa、western blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。利用双单抗夹心elisa法检测大豆过敏原。结果表明:获得6株可稳定分泌鼠抗大豆主要过敏原gly m bd 30k蛋白的单克隆抗体,分别命名为1c10,1d12,2d1,4b4,5f9,6b12,其ig亚型除1d12和4b4为igg2a外,其余均为igg1,且6株单抗效价均在10-5以上。elisa和western blotting分析表明该6株单抗均能特异性识别大豆主要过敏原gly m bd 30k蛋白,并且建立双单抗夹心elisa的方法可以准确检测出大豆过敏原的存在。鼠抗大豆主要过敏原gly m bd 30k蛋白抗原表位区蛋白的单克隆抗体的成功制备,以及双单抗夹心elisa检测系统的建立,为大豆主要过敏原蛋白的检测奠定了基础,也可以为食品中大豆过敏原的检出提供依据。
大豆主要过敏原Gly m Bd 30K的抗原表位区基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定
作者: 林苏霞, 王晓梅, 刘志刚, 曾梦雅, 吴研, 陈家杰 主题: 大豆主要过敏原, Gly m Bd 30k, 抗原表位区, 基因克隆 年份: 2010
摘要: 根据文献并结合生物信息学方法选取大豆主要过敏原gly m bd 30k的抗原表位区,采用pcr方法扩增出该抗原表位区基因片段,并通过酶切连接分别构建单体的pet表达载体(pet-sgly)和二聚体的pet表达载体(pet-dgly),重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)plyss,经iptg诱导后进行sds-page分析;同时用ni2+离子亲和层析柱纯化表达的sgly和dgly抗原表位蛋白,用western-blotting和elisa检测重组蛋白的免疫原性。结果表明:表达的单体sgly蛋白以可溶性表达为主,而其二聚体dgly蛋白以包涵体形式存在,纯化的sgly和dgly蛋白都具有较好的免疫原性,重组蛋白sgly的抗原性更佳。成功构建的大豆主要过敏原gly m bd 30k蛋白的抗原表位区单体sgly蛋白及其二聚体dgly蛋白的工程菌,为研制大豆主要过敏原的单克隆抗体以制备用于大豆主要过敏原检测的试剂奠定了基础。
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