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花生过敏原Ara h2.02的克隆、表达及免疫学鉴定
作者: 易海涛, 刘志刚, 闫浩, 刘芳, 赵郭存, 夏立新 主题: 花生, 过敏原, Arah2.02, 克隆, 表达, 免疫印迹 年份: 2010
摘要: 通过提取花生总rna,设计特异性引物,rt-pcr克隆花生ara h2.02基因,将反转录的基因连入pmd19-t simple vector,提质粒酶切鉴定并测序,将测序正确的片段连入原核表达载体pet-32a(+)上,并转入bl21(de3)宿主表达菌中,iptg诱导表达、western-blotting检测该重组蛋白的免疫原性.测序结果表明:克隆的花生ara h2.02基因片段全长为519 bp,编码为172个氨基酸,与genbank中蛋白序列100%相同.诱导表达后的蛋白经sds-page鉴定,目的蛋白大小与理论值相符.western-blotting结果表明该蛋白能与花生过敏病人混合血清中的ige结合,具有免疫原性.成功克隆并表达了花生过敏原ara h2.02,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性.
鸡蛋主要过敏原Gal d 3基因的克隆、表达、纯化及免疫学鉴定
作者: 吴序栎, 杨志华, 刘志刚, 吴海强 主题: 鸡蛋, 过敏原, 基因克隆, 表达, Gald3 年份: 2009
摘要: 目的:克隆表达鸡蛋主要过敏原gal d 3基因并检验其免疫活性。方法:提取鸡蛋的总rna,采用rt- pcr方法扩增出目的基因片段,将其克隆入t载体中进行测序和分析。设计带有酶切位点的特异性引物,采用rt- pcr获得整个短的开放阅读框并将目的基因克隆到大肠杆菌表达载体pet-28a中进行诱导表达。通过ni~(2+)亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用免疫印迹(western blotting)方法检测其ige结合活性。结果:克隆获得了鸡蛋主要过敏原gal d 3。基因开放阅读框为2118个碱基(包括终止密码子),编码705个氨基酸。该序列编码的蛋白等电点为6.5,相对分子质量约为76000。表达产物经亲和层析纯化,用western blotting方法检测免疫学活性,目的蛋白具有良好的免疫原性。结论:成功地克隆和表达了鸡蛋主要变应原gal d 3基因,该蛋白具有良好的免疫原性。
红星梭子蟹变应原原肌球蛋白基因的克隆、表达及其免疫学鉴定
作者: 吴凯威, 刘志刚 主题: 红红星梭子蟹, 变应原, 原肌球蛋白, 基因克隆, 表达, MALDI-TOF-MS质谱 年份: 2009
摘要: 克隆、表达红星梭子蟹蟹肉中变应原原肌球蛋白(tropomyosin),并对其免疫学特性进行鉴定。rt-pcr克隆红星梭子蟹(portunus sanguinolentus)蟹肉中变应原原肌球蛋白的全长基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增蟹tropomyosin的完整开放阅读框,与pet-28a载体连接并转化大肠杆菌escherichia.colibl21(de3),诱导表达后,ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,western-blot检测其免疫学活性,胰酶消化后进行maldi-tof-ms质谱分析鉴定。克隆所得蟹tropomyosin基因包括一个编码285个氨基酸的开放阅读框。序列分析结果显示所克隆得到的基因与已知虾、螨、蟑螂等的tropomyosin变应原基因有较高的同源性(>80%)。根据变应原的命名规则,将其命名为pors1,并提交genbank数据库,登录号为ef143836。重组蟹tropomyosin在大肠杆菌中能高效的表达,表达产物经ni2+亲和层析柱纯化后进行western-blot检测,结果显示该重组蛋白具有良好的免疫学活性,maldi-tof-ms质谱分析进一步证实了该重组变应原的正确性。本研究成功克隆和表达了红星梭子蟹变应原tropomyosin,为蟹过敏性疾病的诊断和治疗奠定了基础。
平榛主要过敏原Cor h 1的克隆表达、纯化及免疫学鉴定
作者: 莫绪成, 吴序栎, 刘志刚 主题: 平榛, Cor h1, 基因克隆, 表达 年份: 2009
摘要: 目的克隆、表达榛(平榛)主要变应原基因cor h1,检测其免疫学活性。方法提取平榛的总rna,设计带有酶切位点的特异性引物,采用rt-pcr方法扩增目的基因,将其克隆入t载体中进行测序和分析。采用rt-pcr获得整个短的开放阅读框并将目的基因克隆到大肠杆菌表达载体pet28a中进行表达。通过ni2+亲和层析,对重组蛋白进行纯化,采用免疫印迹(western-blot)方法检测其ige结合活性。结果克隆获得了平榛的主要过敏原cor h1的基因,该基因被genbank收录,登陆号为eu195058。基因开放阅读框为486个碱基(包括终止密码子),编码161个氨基酸。该序列编码的蛋白等电点为6.16,相对分子质量约为17600。结论成功地克隆和表达了平榛主要变应原cor h1,蛋白具有良好的免疫原性。
鸡蛋主要过敏原Gal d1片段基因的克隆、表达、纯化及免疫学鉴定
作者: 马艳梅, 黄钟, 刘志刚, 闫浩, 王和平, 罗新萍, 孔小丽 主题: 鸡蛋过敏原, Gald1, 克隆, 表达 年份: 2010
摘要: 目的克隆、表达和纯化鸡蛋主要过敏原gald1区基因,并对其免疫学活性进行鉴定。方法用生物信息学方法对鸡蛋主要过敏原gald1基因进行抗原表位预测,设计特异性引物,用pcr的方法分别扩增gald1n端和c端基因,将其分别连接到原核表达载体pet32a上。重组质粒转入大肠杆菌,用iptg诱导表达,通过镍亲和柱层析法纯化重组蛋白,最后用western-blotting检测重组蛋白的免疫原性。结果表达的蛋白均以可溶性为主,n端融合蛋白相对分子质量为28600,c端融合蛋白相对分子质量为26800,纯化的n端和c端蛋白均有较好的免疫原性,c端的免疫原性强于n端。结论成功地克隆和表达了鸡蛋主要变应原基因gald1的n端和c端,为鸡蛋过敏的诊断和免疫治疗奠定了基础。
牛奶主要过敏原α_(s1)-酪蛋白全长与片段区基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定
作者: 曹燕娟, 胡东生, 刘志刚, 陈思, 罗新萍, 黄钟 主题: 牛奶过敏原, αs1-酪蛋白, 基因克隆, 表达 年份: 2010
摘要: 目的:克隆并表达牛奶中主要过敏原αs1-酪蛋白的全长及n端、c端两个片段区基因,用于筛选与制备牛奶主要过敏原的单克隆抗体。方法:利用rt-pcr技术克隆αs1-酪蛋白基因,测序后将目的片段克隆入原核表达质粒pet载体,转化至大肠杆菌(e.coli)bl21(de3)。经iptg诱导表达,获得重组αs1-酪蛋白。用ni2+亲和层析柱纯化,用western blot和elisa检测重组蛋白与牛奶过敏患者血清ige的结合活性。结果:克隆获得αs1-酪蛋白全长的开放阅读框基因为645bp(含终止密码子),编码214个氨基酸。n、c端片段区基因(含终止密码子)分别为285、294bp,编码94、97个氨基酸。三种重组蛋白均能以可溶性表达形式纯化,经western blot和elisa检测都具有较好的免疫原性,而αs1-酪蛋白全长的免疫原性更强。结论:成功地克隆和表达了αs1-酪蛋白全长及n、c端两个片段区基因,为研制牛奶主要过敏原的单克隆抗体,制备牛奶主要过敏原的检测试剂奠定了基础。
鸡蛋主要过敏原卵类粘蛋白基因的克隆及原核载体构建与表达
作者: 陈大玮, 邬玉兰, 刘志刚, 吴序栎, 孔小丽 主题: 鸡蛋, 卵类粘蛋白, 基因克隆, 原核载体, 表达 年份: 2009
摘要: 目的:本研究利用pet表达载体克隆,表达鸡蛋主要过敏原卵类粘蛋白基因,为鸡蛋过敏疾病的特异性诊断和治疗以及进一步的实验研究奠定了一定的基础。方法:提取鸡输卵管组织总rna,利用rt-pcr技术扩增卵类粘蛋白基因(ovomucoid,ovm),并与已知序列进行同源性比较,将该片段连接入原核表达载体pet-28a,iptg诱导表达目的蛋白。结果:成功克隆鸡蛋主要过敏原卵类粘蛋白(ovomucoid,ovm)的全长基因,该基因的开放阅读框长度为633bp(包括终止密码子),编码210个氨基酸,与genbank提供的ovm基因序列同源性达99%。该序列编码的蛋白为小分子量蛋白,相对分子质量约为21kd,与理论值均相符。iptg诱导表达后,sds-page分析表明目的蛋白在宿主大肠杆菌bl21(de3)中高效表达。结论:本研究采用体外重组的方法克隆出卵类粘蛋白基因,并实现在大肠杆菌中大量表达,这为后续鸡蛋食品基础性研究奠定基础。
粉尘螨Ⅱ类变应原的克隆表达、纯化及其免疫学特性
作者: 朱健琦, 刘志刚, 高波, 吉坤美, 邢苗 主题: 粉尘螨, 变应原, 表达, 纯化 年份: 2006
摘要: 目的获得大量具有良好的ige结合活性的der fⅱ重组变应原,以促进粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断及治疗的研究。方法挑取经纯培养的粉尘螨,提取总rna,采用rt-pcr的方法扩增der fⅱ片段,产物连接进入t载体(pmd18)。经扩增后,用ndeⅰ和xhoⅰ双酶切后将目的片段连接到pet-24a表达载体上,得到重组质粒pet-der f2,工程菌经iptg诱导培养,明显表达出der fⅱ蛋白,表达产物经固定化金属配体亲和层析纯化,用western blot检测免疫学活性。结果成功提取粉尘螨的总rna,扩增出编码129个氨基酸的长度为387个碱基对的核苷酸片段。序列分析结果和genebank上的基因序列(d10448)同源性98%,其中有6个碱基不同。使用高效表达的原核载体pet,所得产物的5′端含有抗原性极小的6个组氨酸标签。表达质粒在e.colibl21 star中得到高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,目的蛋白具有良好的变应原性。结论成功构建了粉尘螨ⅱ类变应原的原核表达载体,并纯化了具有免疫特性的重组蛋白,为进一步开展der fⅱ蛋白和重组疫苗研究奠定了基础。
美洲大蠊变应原Cr-PII基因的克隆、表达及结构预测
作者: 何毅华, 刘志刚, 邢苗, 杨豪 主题: 美洲大蠊, 变应原, Cr-pII, 克隆, 表达 年份: 2006
摘要: 采用rt-pcr技术从美洲大蠊中扩增出变应原cr-pii基因,并将其克隆至pmd18-t载体中。经序列测定和分析证实,所克隆的片段含有长度为1185bp的完整开放阅读框(orf),与台湾株来源的cr-pii(per a1·0103)有95·9%的同源性。用ndeⅰ和notⅰ将目的片段从t载体中切下,定向亚克隆入表达载体pet24a(+),然后成功转化大肠杆菌菌株bl21star。经iptg诱导得到45kda的重组蛋白,western-blot分析表明其具有良好的ige结合活性。并通过生物信息学方法获得了目的蛋白的抗原表位和3d结构模型。
粉尘螨Ⅰ类变应原(Der fⅠ)的克隆表达、纯化及免疫学特性
作者: 朱健琦, 刘志刚, 高波, 吉坤美, 邢苗 主题: 粉尘螨, 变应原, 表达, 纯化, 特性鉴定 年份: 2006
摘要: 粉尘螨ⅰ类变应原(der fⅰ)是粉尘螨dermatophagoidesfarinae主要变应原,可引发ⅰ型变态反应。挑取纯培养的粉尘螨,提取总rna,采用rt-pcr方法有效地扩增出derfⅰ片段,产物连接入t载体(pmd18)。经扩增后,用ndeⅰ和xhoⅰ双酶切后将目的片段连接到pet24a表达载体上,得到重组质粒pet24a-derfⅰ,工程菌经iptg诱导培养,高效表达出derfⅰ蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在。表达产物经亲和层析纯化,用westernblot及elisa方法检测免疫学活性,结果表明目的蛋白具有良好的免疫原性。
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