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美洲大蠊重组BCG-CrPI变应原的免疫原性
作者: 郑小玲, 夏慧敏, 周珍文, 黄钰君, 刘志刚, 吴晓蔓 主题: 美洲大蠊, 卡介苗, 变应原, 疫苗 年份: 2009
摘要: 目的对表达美洲大蠊cr pi变应原的卡介苗(bcg)进行免疫原性评估,为bcg脱敏疫苗的研制提供实验基础。方法106cfu重组bcg-cr pi包下注射免疫balb/c小鼠,分别于免疫0、2、4、6、8周收集血清。使用纯化的重组cr pi被elisa板,elisa检测cr pi特异性igg及igg1、igg2 a亚类。结果重组bcg-cr pi皮下注射免疫balb/c小鼠2周后,血清cr pi特异性igg显著高于对照组(p<0.05),实验组igg1及igg2 a也显著高于对照组(p<0.05),igg2 a升高更明显。结论重组美洲大蠊bcg-cr pi具免疫原性,并且诱th1优势免疫应答。
美洲大蠊Per a7基因的克隆、表达及免疫学鉴定
作者: 刘志刚, 何毅华, 吴海强, 朱永峰 主题: 美洲大蠊, 变应原, 原肌球蛋白, Per a7基因, 免疫鉴定 年份: 2007
摘要: 根据原肌球蛋白基因序列设计引物,以我国南方地区美洲大蠊periplaneta americanarna为模板,用rt-pcr方法扩增出852bp的全长编码片段,经序列分析发现该基因与ncbi公布的per a7有3个核苷酸发生改变。将目的片段克隆到pet24a(+)表达载体中,在大肠杆菌bl21star获得表达,融合蛋白的分子量约为33kd。利用蟑螂过敏性患者血清对表达产物进行western blotting检测,出现明显的识别条带,说明表达产物具有ige结合活性。
美洲大蠊变应原Cr-PII基因的克隆、表达及结构预测
作者: 何毅华, 刘志刚, 邢苗, 杨豪 主题: 美洲大蠊, 变应原, Cr-pII, 克隆, 表达 年份: 2006
摘要: 采用rt-pcr技术从美洲大蠊中扩增出变应原cr-pii基因,并将其克隆至pmd18-t载体中。经序列测定和分析证实,所克隆的片段含有长度为1185bp的完整开放阅读框(orf),与台湾株来源的cr-pii(per a1·0103)有95·9%的同源性。用ndeⅰ和notⅰ将目的片段从t载体中切下,定向亚克隆入表达载体pet24a(+),然后成功转化大肠杆菌菌株bl21star。经iptg诱导得到45kda的重组蛋白,western-blot分析表明其具有良好的ige结合活性。并通过生物信息学方法获得了目的蛋白的抗原表位和3d结构模型。
美洲大蠊特异性抗原的蛋白印迹分析
作者: 韩国庆, 刘志刚, 阴伟雄, 胡川, 白羽, 林立丰 主题: 美洲大蠊, 抗原, SDS-PAGE, Western-blotting 年份: 2006
摘要: 目的探讨美洲大蠊不同时期抗原成份分析以及特异性抗原组分鉴定。方法本文通过采用coca's提取液提取得到美洲大蠊粗浸液抗原,通过饱和(nh4)2so4沉淀以及十二烷基磺酸钠聚丙酰胺凝胶电泳(sds-pase),对其抗原成份进行分析,并选用对蟑螂过敏性疾病患者阳性血清进行免疫印迹试验(western-blotting)。结果美洲大蠊成虫、若虫、幼虫、虫卵生活史不同时期及不同部位抗原各有不同数量的蛋白条带,但生活史各阶段均出现6条蛋白主带,分别为:92、78、66、56、52和40kd,免疫印迹显示其92、78、49和26kd为美洲大蠊成虫特异性变应原,其中78kd是主要变应原。结论美洲大蠊78kd蛋白为主要变应原,92、49和26kd为次要变应原,本研究为蟑螂变应原诊断试剂和疫苗的研制奠定了基础。
化学发光免疫法检测美洲大蠊sIgE水平的研究
作者: 王勤, 刘志刚, 吉坤美 主题: 美洲大蠊, 特异性变应原, sIgE, 化学发光, 酶联免疫 年份: 2006
摘要: 将6只美洲大蠊全虫用液氮研磨提取粗浸液,用阴离子交换剂(deae,sephadexa-50)纯化后测定蛋白浓度,并配制成不同浓度梯度,分别将粗浸液及纯化后的不同浓度变应原点于硝酸纤维膜(nc膜)上,依次加入不同蟑螂过敏患者血清、生物素-亲和素系统的ige二抗和辣根过氧化物酶(hrp),以及鲁米诺化学发光底物进行化学发光反应。结果表明,化学发光免疫法可检测美洲大蠊粗浸液最低蛋白浓度为0.87μg/ml。在此浓度下,其检出结果与皮试阳性患者血清符合率为90%,与皮试阴性及健康人血清的符合率均为100%。
美洲大蠊消化系统形态学观察
作者: 包莹, 刘志刚, 蒋灵芝 主题: 美洲大蠊, 消化系统, 形态学 年份: 2007
摘要: 为探讨美洲大蠊(periplaneta americana)消化系统结构,通过连续石蜡切片和he染色技术制备并观察美洲大蠊切片。结果显示,美洲大蠊消化道占据体腔大部分空间,其中前肠长度约占整个消化道长度的一半,肠壁薄,前胃中含有高度硬化的齿,便于磨碎食物;中肠是美洲大蠊消化吸收的主要部位,肠壁细胞包括单层柱状上皮细胞和再生细胞;后肠包括回肠、结肠和直肠3部分。回肠肌肉层较厚,经过回肠瓣后成为结肠。直肠肠壁细胞特化为长形垫状突起,突出于肠腔中形成直肠垫。本文为进一步阐明蟑螂结构与消化机制和变应原理论基础提供依据。
美洲大蠊精氨酸激酶基因的克隆、表达及变应原活性测定
作者: 陈家杰, 夏立新, 刘志刚, 刘雯, 吉坤美 主题: 美洲大蠊, 精氨酸激酶, 基因表达, 变应原活性 年份: 2008
摘要: 目的克隆美洲大蠊(periplaneta americana)精氨酸激酶(arginine kinase,ak)基因并表达、纯化具有变应原活性的重组ak。方法提取美洲大蠊总rna,设计特异引物,通过rt-pcr克隆美洲大蠊ak基因目的片段,测序后将该片段克隆入原核表达载体pet-28a,转化至大肠埃希菌(e.coli)bl21(de3),经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导表达,获重组ak。用镍离子(ni2+)亲和层析柱纯化,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析重组ak表达情况。用蛋白质印迹分析(western blotting)(变性条件)和elisa(非变性条件)检测重组ak变应原与过敏患者血清ige结合活性,并以健康人血清为对照。结果测序结果表明,ak基因含有1068bp的开放阅读框,编码356个氨基酸(登录号为eu429466)。与gen bank公布的序列(登录号为ay563004)比较同源性达99.9%。sds-page分析表明,该变应原基因在e.coli中主要以可溶形式高水平表达,相对分子质量约为mr45000。重组变应原ak在变性与非变性条件下,与过敏患者血清ige均具有良好的结合活性,与健康人对照组之间的差异具有统计学意义(p<0.05)。结论获得了具有变应原活性的重组美洲大蠊精氨酸激酶。
美洲大蠊主要变应原的纯化与免疫学鉴定
作者: 胡川, 刘志刚, 林立丰, 阴伟雄, 李金生 主题: 美洲大蠊, 变应原, 层析, 鉴定, 纯化 年份: 2005
摘要: 为利用蛋白纯化技术获得较高纯度美洲大蠊天然主要变应原,以进一步提高临床诊断的特异性和免疫治疗疗效。美洲大蠊全虫粗浸液通过de-52离子交换层析、hiprepsephacryls-200凝胶过滤层析等分离步骤得到了纯度为90%的目的蛋白,回收率为26%,经westernblotting分析74kda的蛋白质具有免疫原性,为变应原疫苗的纯化和标准化奠定了基础。
美洲大蠊变应原CrPI的表达、纯化与免疫学特性鉴定
作者: 高波, 刘志刚, 邢苗, 徐宏, 罗时文, 赖仞 主题: 美洲大蠊, 重组变应原CrPI, 蛋白表达, 亲和层析, 免疫印迹 年份: 2005
摘要: 以阳性噬菌体克隆为模板 ,通过pcr扩增出目的基因片段并克隆入t载体 ,经测序证实为美洲大蠊periplanetaamericana变应原crpi后 ,将该基因亚克隆入表达载体pgex 5x 1。美洲大蠊变应原crpi在大肠杆菌中得到高效表达 ,但主要以包涵体形式存在于沉淀中。目的蛋白溶于 6mol l盐酸胍并经稀释复性后 ,经glutathionesepharosetm 4b亲和层析 ,纯度达 90 %以上。以蟑螂过敏病人血清进行免疫印迹检测 ,结果显示重组变应原具有良好的ige结合活性。
美洲大蠊主要变应原蛋白的质谱鉴定与分析
作者: 胡川, 刘志刚, 李金生, 韩庆国, 林立丰, 阴伟雄 主题: 美洲大蠊, 液相色谱, 电喷雾, 串联质谱, 变应原, 鉴定 年份: 2005
摘要: 为了建立美洲大蠊 periplaneta americana变应原蛋白的质谱鉴定方法, 我们将美洲大蠊粗浸液通过 deae-52 离子交换层析、sephacryl s-200凝胶过滤层析等分离步骤得到纯化的74 kd蛋白, 对纯化前后的该74 kd蛋白分别进行sds-page及凝胶内胰酶酶切, 再经液相色谱-电喷雾-串联质谱 (hplc-esi-ms-ms) 在线联机分析, 所得质谱数据进入网站 (http: www.matrixscience. com) 进行mascot检索比对。通过对两者质谱鉴定结果的比较来评估美洲大蠊天然主要变应原蛋白的纯化效果。结果表明, 纯化蛋白经hplc-esi-ms-ms鉴定是美洲大蠊主要变应原蛋白; 离子交换层析等纯化步骤可以去除同一分子量的杂蛋白 (如卵黄原蛋白), 从而获得较好的鉴定结果。我们首次成功地运用质谱建立起变应原蛋白的新鉴定方法。
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