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黑虎虾Crustin的克隆表达纯化及抑菌活性测定
作者: 徐栋梁, 朱超亚, 彭永鹤, 夏立新, 刘志刚 主题: 黑虎虾, 抗菌肽, 克隆, 纯化, 抑菌活性 年份: 2010
摘要: 从黑虎虾血淋巴细胞中提取总rna,经rt-pcr扩增编码crustin成熟肽的cdna序列,将其克隆至pmd18-t载体进行扩增,然后克隆到pet-32a(+)表达载体中,转化至e.coliorigamitm(de3)中表达crustin抗菌蛋白,后通过ni2+亲和层析柱纯化获得crustin蛋白,采用滤纸片扩散法检测该蛋白的抑菌活性。表达出的crus-tin蛋白分子量约14.7 kda,滤纸片扩散法显示crustin蛋白对绿色木霉具有抑制活性。
拟穴青蟹抗菌肽CrusSp基因克隆表达及抑菌活性分析
作者: 徐栋梁, 李洁颖, 彭永鹤, 夏立新, 刘志刚 主题: 拟穴青蟹, 抗菌肽, 克隆, 纯化, 抑菌活性 年份: 2011
摘要: 从拟穴青蟹血淋巴细胞提取总rna,经rt-pcr扩增编码crussp成熟肽的cdna序列,克隆至pet-32a(+)表达载体中,转化至e.coli origamitm(de3)中表达crussp蛋白,通过ni2+亲和层析柱纯化获得crussp蛋白,表达出的crussp蛋白相对分子量约10.27 ku,等电点为8.54,滤纸片扩散法结果显示crussp蛋白抑制绿色木霉.
花生主要过敏原Ara h1的纯化
作者: 吴序栎, 肖杰, 刘志刚, 吕志平, 刘骏杰 主题: 花生, Ara h1, 蛋白, 纯化, 过敏 年份: 2011
摘要: 采用硫酸铵沉淀及凝胶过滤层析方法,纯化花生主要过敏原蛋白ara h1,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)结合免疫印迹实验(western-blotting)进行鉴定。结果表明:可纯化出纯度90%以上的ara h1过敏原蛋白。
花生过敏原Ara h 8的克隆表达、纯化及免疫学鉴定
作者: 易海涛, 刘志刚, 刘芳, 闫浩, 汤慕瑾, 肖小军, 夏立新 主题: 花生, 过敏原, Ara h 8, 克隆表达, 纯化, 免疫印迹 年份: 2011
摘要: 目的:克隆花生主要过敏原ara h 8基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法:提取花生总rna,设计特异性引物,rt-pcr克隆花生ara h 8基因;将反转录的基因连入pmd19-t simple vector,提质粒酶切鉴定并测序。将测序正确的片段连入原核表达载体pet-32a(+)上,并转入bl21(de3)宿主表达菌中;iptg诱导表达;通过ni2+亲和层析(fplc)纯化目的蛋白ara h 8;western blot检测该重组蛋白的免疫原性。结果:测序结果表明克隆的花生ara h 8基因片段全长为474 bp,编码157个氨基酸,与genbank中蛋白序列100%相同。重组蛋白纯化后经sds-page鉴定,目的蛋白大小与理论值相符。western blot结果表明该蛋白与花生过敏病人混合血清中ige结合,具有免疫原性。结论:成功克隆并表达纯化了花生过敏原ara h 8,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。
克氏原螯虾主要变应原原肌球蛋白的一个片段区基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定
作者: 易海涛, 夏立新, 刘芳, 闫浩, 黄钟, 汤慕瑾, 陈大玮, 刘志刚 主题: 克氏原螯虾, 原肌球蛋白, 变应原, 克隆表达, 纯化, 免疫印迹, 酶联免疫吸附测定 年份: 2011
摘要: 克隆克氏原螯虾主要过敏原原肌球蛋白的一个片段区基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫原性.提取克氏原螯虾总rna,设计特异性引物,rt-pcr克隆得到目的基因;将目的基因连入pmd19-t载体,提质粒酶切鉴定并测序;将测序正确的片段连入原核表达载体pet-32a(+)上,并转入bl21(de3)宿主表达菌中;iptg诱导表达;通过ni2+亲和层析(fplc)纯化目的蛋白;利用western-blotting和elisa检测该重组蛋白的免疫原性.克隆获得目的基因,其片段长为291 bp,编码97个氨基酸.重组蛋白纯化后经sds-page鉴定,目的蛋白大小与理论值相符.western-blotting和elisa结果表明该蛋白与克氏原螯虾过敏病人混合血清中ige结合,具有免疫原性.
椰子花粉过敏原基因的克隆表达、纯化及免疫学鉴定
作者: 孟光, 姚敏, 刘志刚, 邬玉兰, 张红云 主题: 椰子花粉, profilin, 基因表达, 纯化, 鉴定 年份: 2009
摘要: 目的:克隆并表达椰子花粉中泛变应原肌动蛋白抑制蛋白(profilin)。方法:利用rt-pcr结合race技术克隆椰子花粉中泛变应原profilin的全长基因,并进行序列分析。然后设计带有酶切位点的特异性引物,采用rt-pcr获得整个椰子花粉profilin的开放阅读框,将其与pet28a载体连接并转化大肠杆菌bl21(de3)进行诱导表达,通过ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用western blot检测其ige结合活性。结果:克隆获得了椰子花粉profilin的全长基因,由608个碱基组成,开放阅读框为396个碱基(包括终止密码子),编码131个氨基酸。经分析,这个序列编码的蛋白为小分子量酸性蛋白,等电点为4.61,分子量约为14 kd。此序列已被genebank收录,登陆号为ef173598。重组椰子花粉profilin在大肠杆菌中高效的表达和纯化后,经western blot检测具有良好的免疫学活性。结论:成功地克隆和表达了椰子花粉profilin,为该花粉profilin用于椰子花粉过敏诊断和免疫治疗提供了理论依据。
粉尘螨Ⅱ类变应原的克隆表达、纯化及其免疫学特性
作者: 朱健琦, 刘志刚, 高波, 吉坤美, 邢苗 主题: 粉尘螨, 变应原, 表达, 纯化 年份: 2006
摘要: 目的获得大量具有良好的ige结合活性的der fⅱ重组变应原,以促进粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断及治疗的研究。方法挑取经纯培养的粉尘螨,提取总rna,采用rt-pcr的方法扩增der fⅱ片段,产物连接进入t载体(pmd18)。经扩增后,用ndeⅰ和xhoⅰ双酶切后将目的片段连接到pet-24a表达载体上,得到重组质粒pet-der f2,工程菌经iptg诱导培养,明显表达出der fⅱ蛋白,表达产物经固定化金属配体亲和层析纯化,用western blot检测免疫学活性。结果成功提取粉尘螨的总rna,扩增出编码129个氨基酸的长度为387个碱基对的核苷酸片段。序列分析结果和genebank上的基因序列(d10448)同源性98%,其中有6个碱基不同。使用高效表达的原核载体pet,所得产物的5′端含有抗原性极小的6个组氨酸标签。表达质粒在e.colibl21 star中得到高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,目的蛋白具有良好的变应原性。结论成功构建了粉尘螨ⅱ类变应原的原核表达载体,并纯化了具有免疫特性的重组蛋白,为进一步开展der fⅱ蛋白和重组疫苗研究奠定了基础。
粉尘螨Ⅰ类变应原(Der fⅠ)的克隆表达、纯化及免疫学特性
作者: 朱健琦, 刘志刚, 高波, 吉坤美, 邢苗 主题: 粉尘螨, 变应原, 表达, 纯化, 特性鉴定 年份: 2006
摘要: 粉尘螨ⅰ类变应原(der fⅰ)是粉尘螨dermatophagoidesfarinae主要变应原,可引发ⅰ型变态反应。挑取纯培养的粉尘螨,提取总rna,采用rt-pcr方法有效地扩增出derfⅰ片段,产物连接入t载体(pmd18)。经扩增后,用ndeⅰ和xhoⅰ双酶切后将目的片段连接到pet24a表达载体上,得到重组质粒pet24a-derfⅰ,工程菌经iptg诱导培养,高效表达出derfⅰ蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在。表达产物经亲和层析纯化,用westernblot及elisa方法检测免疫学活性,结果表明目的蛋白具有良好的免疫原性。
屋尘螨变应原Der p 1基因原核表达产物的纯化及特性鉴定
作者: 刘志刚, 杨慧, 付颖媛, 高波, 朱健琦, 吉坤美 主题: 屋尘螨, 变应原, Derp1, 融合蛋白, 复性, 纯化 年份: 2006
摘要: 目的建立屋尘螨主要变应原derp1蛋白原核表达产物的纯化方法,获得理想的表达产物并鉴定其免疫原性。方法大量诱导表达含pet24a-derp1质粒的bl21工程菌,表达产物以重组蛋白包涵体的形式存在,包涵体经洗涤与溶解后,使用结合6组氨酸的镍柱进行亲和层析纯化蛋白质,用稀释复性方法进行重组蛋白的复性,再用屋尘螨过敏性哮喘患者阳性血清经dot-elisa方法分析derp1纯化蛋白的抗原活性。结果分步洗涤可有效去除重组蛋白包涵体沉淀中混杂的多数杂蛋白成分,亲和层析分离可获得高纯度重组变应原derp1蛋白。dot-elisa法检测结果表明经复性并纯化的derp1蛋白呈强阳性反应,最佳血清稀释度为1∶64,而重组蛋白与正常人血清呈阴性反应。结论纯化后的融合蛋白derp1具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为有效的屋尘螨变应原诊断试剂和疫苗的候选分子。
粉尘螨6类变应原(Derf6)的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定
作者: 朱永烽, 刘志刚, 高波 主题: 粉尘螨, Derf6, 基因表达, 纯化, 蛋白质印迹 年份: 2006
摘要: 目的构建粉尘螨6类变应原(dermatophagoides farinae,derf6)基因的高效原核表达载体,并进行表达、纯化及生物学功能分析。方法根据derf6基因已知序列,设计1对引物,通过对纯培养的粉尘螨提取总rna,采用rt-pcr方法扩增出derf6基因片段,pcr产物克隆入pmd18-t载体,转化大肠埃希菌(e.colitop10),经pcr和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pmd18-t-derf6和空质粒pet-24a同时用限制性内切酶ecorⅰ和xhoⅰ双酶切,经纯化后连接并转化至e.colitop10。构建的重组质粒pet24a-derf6经pcr、酶切和测序鉴定后,再转化至e.colibl21(de3),异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)和蛋白质印迹法(westernblotting)鉴定其表达效果,用ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pet24a-derf6表达产生的组氨酸重组蛋白。结果构建了重组质粒pmd18-t-derf6和pet24a-derf6。sds-page结果表明derf6基因在e.colibl21(de3)中获得良好的表达,所得重组蛋白相对分子质量(mr)为31000,与理论值一致,经亲和层析纯化后,sds-page结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行westernblotting,结果表明具有良好的ige结合活性。结论克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者ige结合活性的derf6。
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