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标准化粉尘螨疫苗免疫治疗哮喘小鼠气道炎症的实验研究
作者: 刘晓宇, 闫浩, 李盟, 李荔, 刘志刚, 喻海琼 主题: 粉尘螨, 疫苗, 哮喘, 免疫治疗, 机理 年份: 2011
摘要: 目的建立小鼠粉尘螨过敏性哮喘模型,探讨标准化粉尘螨疫苗免疫治疗的疗效及机理。方法 32只balb/c小鼠随机分为阴性对照组(a组)、哮喘模型组(b组)、粉尘螨疫苗低剂量治疗组(c组)、粉尘螨疫苗高剂量治疗组(d组)。a组始终给予生理盐水,b、c、d组腹腔注射50μg粉尘螨提取液和2 mg al(oh)3免疫小鼠致敏。然后分别用pbs(50μl)、100μg、1 mg的粉尘螨粗提液皮下注射进行免疫治疗,各组用粉尘螨抗原(50μg/50μl)滴鼻激发,末次激发后24 h用气道高反应仪检测小鼠气道反应性;处死小鼠,收集支气管肺泡灌洗液(balf)、血清以及取出小鼠的脾细胞进行后续检测。结果 b组、c组肺泡灌洗液中细胞总数和嗜酸性细胞数显著升高,气道反应性明显增强,两组相比无显著性差异。与之相比,d组气道反应性明显下降,肺泡灌洗液中细胞总数和嗜酸性细胞数显著降低(p<0.01)、der.f特异性抗体ige显著降低、支气管肺泡灌洗液上清中il-4降低(p<0.05),il-10、ifn-r的含量显著增高(p<0.05),细胞增殖反应显示d组受抑制。结论粉尘螨疫苗可以有效抑制哮喘模型肺部炎症变化和降低气道高反应性,其疗效与剂量有关,机制可能与调节th1/th2平衡有关。
粉尘螨壳聚糖纳米疫苗舌下含服对哮喘小鼠的治疗作用
作者: 喻海琼, 刘志刚, 国华, 周一平 主题: 粉尘螨, 壳聚糖, 纳米颗粒, 舌下含服疫苗, 免疫治疗 年份: 2011
摘要: 目的制备粉尘螨(dermatophagoides farinae)壳聚糖纳米疫苗,并观察其免疫治疗哮喘小鼠的效果。方法采用离子凝胶法制备粉尘螨壳聚糖纳米疫苗。30只balb/c小鼠随机均分为5组,阴性对照组(a组)用生理盐水处理,其余组用50μg粉尘螨粗提液+2mg氢氧化铝腹腔注射致敏,第28天开始分别用pbs(b组,模型组)、空白壳聚糖(c组)、粉尘螨变应原(der f)组(d组,1mg/次)和粉尘螨壳聚糖纳米疫苗(dcn)(e组,负荷1mg der f的dcn/次)舌下含服免疫18次,每次间隔1d,末次免疫后1周用50μg粉尘螨变应原滴鼻激发,每天1次,连续7次。末次激发后24 h检测小鼠的气道高反应性;末次激发后48 h处死小鼠,取血,行肺泡灌洗,无菌摘取肺组织和脾脏;计数小鼠肺泡灌洗液(balf)中细胞总数和嗜酸粒细胞数,观察balf和脾细胞上清中il-4、il-10和ifn-γ细胞因子水平,血清中ige、iga和igg2a抗体水平;运用he染色观察肺部炎症细胞的浸润程度,运用mtt法检测脾细胞的淋巴细胞增殖反应,计算刺激指数(si)。结果与b组相比,d、e组气道高反应性和肺部病理改变减轻。d组(36.50×104/ml,3.72×104/ml)和e组(34.25×104/ml,2.25×104/ml)的balf中细胞总数、嗜酸粒细胞数显著少于b组(61.67×104/ml,14.17×104/ml)(p<0.05)。与b组(ige:0.39,iga:0.79)相比,d组和e组血清中抗原特异性ige抗体水平(d:0.22,e:0.22)显著降低,而iga抗体水平(d:0.88,e:1.03)显著升高。d组和e组的balf中il-4水平(d:28.49pg/ml,e:20.93pg/ml)和脾细胞分泌的il-4(d:27.82pg/ml,e:20.80pg/ml)水平均显著低于b组(56.33pg/ml,45.84pg/ml)(p<0.05)。而balf中的ifn-γ(d:18.80 pg/ml,e:37.32 pg/ml)、il-10(d:118.90pg/ml,e:129.15pg/ml)水平显著高于b组(13.60pg/ml,29.61 pg/ml)(p<0.05);脾细胞分泌的ifn-γ(d:20.68 pg/ml,e:42.42 pg/ml)、il-10(d:36.31 pg/ml,e:161.3...
粉尘螨抗细菌活性物质的分离与鉴定
作者: 刘晓宇, 刘瑞涛, 赖仞, 夏立新, 刘志刚, 李荔 主题: 粉尘螨, 丙酮提取液, Sephadex G50层析, 抗细菌活性 年份: 2011
摘要: 目的从粉尘螨丙酮提取液中分离抗细菌活性成分,并对其抗菌活性进行初步鉴定。方法用丙酮抽提粉尘螨,并用sephadex g50分子筛层析进行对粉尘螨提取液中的抗细菌活性进行初步分离、纯化。对各组分的抗细菌活性进行初步鉴定。结果经sephadex g50分子筛层析分离得到ⅰ及ⅱ两个峰。粉尘螨丙酮粗提物对绿脓假单胞菌无抑制作用,但对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及短小芽孢杆菌均有抑制作用。峰ⅰ及峰ⅱ则对大肠埃希杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌都有抑制作用。粉尘螨粗提液及第二个峰在加热及蛋白酶k处理后仍然保留抗细菌活性,但是第一个峰在同样处理后失去了抗菌活性。结论首次从粉尘螨分离纯化得到抗细菌成分。
抗粉尘螨主要变应原Der f1单克隆抗体的制备与鉴定
作者: 顾耀亮, 李佳娜, 陈家杰, 吉坤美, 刘志刚 主题: Der f1, 粉尘螨, 主要变应原, 单克隆抗体, 特性鉴定 年份: 2009
摘要: 目的制备和鉴定鼠抗粉尘螨主要变应原der f1的单克隆抗体(monoclonal antibody,mcab)。方法利用重组der f1蛋白为免疫原,免疫balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤ns-1细胞融合。通过间接elisa法筛选特异性分泌的杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白a亲和层析法进行抗体纯化。采用ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的ig亚型;通过间接elisa、western blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。结果获得6株可稳定分泌鼠抗粉尘螨主要变应原der f1的单克隆抗体,其ig亚型均为igg1,且6株单抗均具有良好的效价。elisa和western-blotting分析表明,该6株单抗均能识别重组der f1蛋白和天然的粉尘螨提取物。其中,除了484不识别屋尘螨提取物,其他均能识别。结论成功制备了6株鼠抗粉尘螨主要变应原der f1的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原der f1检测及纯化方法奠定了基础。
肉桂提取物对粉尘螨杀灭的实验研究
作者: 李静, 吴海强, 刘志刚, 张彩芬, 艾梅 主题: 肉桂提取物, 粉尘螨, 杀螨 年份: 2009
摘要: 目的研究肉桂(cinnamomum cassia presl)不同溶剂提取组分对室内粉尘螨(dermatophagoides farinae)的杀灭活性。方法肉桂粉碎后以石油醚、乙酸乙酯、甲醇为提取剂,分别用索氏提取法、浸渍法提取肉桂的不同有效组分;以作用浓度和作用时间为变量,分别用直接接触法测试肉桂石油醚、乙酸乙酯、甲醇提取组分对粉尘螨的杀灭活性,用熏蒸法测试肉桂石油醚、乙酸乙酯提取组份对粉尘螨的杀灭活性。结果直接接触法测试肉桂不同组分对粉尘螨杀灭活性的结果显示作用24h时肉桂石油醚提取组分和乙酸乙酯提取组分的ld50分别为4.64μg/cm2和1.44μg/cm2,甲醇提取组分对粉尘螨则不具有显著杀灭活性;从作用时间上看,石油醚组分作用时间最短,乙酸乙酯组分次之;熏蒸法测试结果显示肉桂石油醚、乙酸乙酯提取组分使用剂量为6.09μg/cm2和9.75μg/cm2时作用24h后对粉尘螨的致死率即达到100%。结论本文研究结果表明肉桂的石油醚和乙酸乙酯提取组分对粉尘螨具有良好的杀灭活性,呈剂量、时间依赖性,且与作用方式直接相关。
丁香花蕾油对粉尘螨杀灭活性的研究
作者: 李静, 吴海强, 刘志刚 主题: 丁香花蕾油, 粉尘螨, 杀螨剂 年份: 2009
摘要: 用索氏提取法以石油醚为溶剂提取制备丁香花蕾中的挥发油组分,用直接接触法和熏蒸法分别测试不同剂量和不同作用时间丁香花蕾油对粉尘螨的杀灭活性,结果显示12.20μg/cm2丁香花蕾油直接接触粉尘螨后2.5h死亡率即达100.0%,相同剂量的丁香花蕾油在相对封闭的容器中熏蒸24h后,螨虫死亡率为100.0%,表明丁香花蕾油对室内粉尘螨具有较好的杀灭活性。
粉尘螨抗细菌活性物质的分离与鉴定
作者: 刘志刚, 刘瑞涛, 赖仞, 李荔, 夏立新 主题: 粉尘螨, 丙酮提取液, 层析, 抗细菌活性 年份: 2011
摘要: 用丙酮抽提粉尘螨,并用sephadex g50分子筛层析进行分离.研究发现:粉尘螨粗提液、分子筛的第1个峰和第2个峰具有抗细菌活性.粉尘螨粗提液及第2个峰在加热及蛋白酶k处理后仍然保留抗细菌活性,但是第1个峰在同样处理后失去了抗菌活性.
粉尘螨Ⅱ类变应原的克隆表达、纯化及其免疫学特性
作者: 朱健琦, 刘志刚, 高波, 吉坤美, 邢苗 主题: 粉尘螨, 变应原, 表达, 纯化 年份: 2006
摘要: 目的获得大量具有良好的ige结合活性的der fⅱ重组变应原,以促进粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断及治疗的研究。方法挑取经纯培养的粉尘螨,提取总rna,采用rt-pcr的方法扩增der fⅱ片段,产物连接进入t载体(pmd18)。经扩增后,用ndeⅰ和xhoⅰ双酶切后将目的片段连接到pet-24a表达载体上,得到重组质粒pet-der f2,工程菌经iptg诱导培养,明显表达出der fⅱ蛋白,表达产物经固定化金属配体亲和层析纯化,用western blot检测免疫学活性。结果成功提取粉尘螨的总rna,扩增出编码129个氨基酸的长度为387个碱基对的核苷酸片段。序列分析结果和genebank上的基因序列(d10448)同源性98%,其中有6个碱基不同。使用高效表达的原核载体pet,所得产物的5′端含有抗原性极小的6个组氨酸标签。表达质粒在e.colibl21 star中得到高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,目的蛋白具有良好的变应原性。结论成功构建了粉尘螨ⅱ类变应原的原核表达载体,并纯化了具有免疫特性的重组蛋白,为进一步开展der fⅱ蛋白和重组疫苗研究奠定了基础。
粉尘螨Ⅰ类变应原(Der fⅠ)的克隆表达、纯化及免疫学特性
作者: 朱健琦, 刘志刚, 高波, 吉坤美, 邢苗 主题: 粉尘螨, 变应原, 表达, 纯化, 特性鉴定 年份: 2006
摘要: 粉尘螨ⅰ类变应原(der fⅰ)是粉尘螨dermatophagoidesfarinae主要变应原,可引发ⅰ型变态反应。挑取纯培养的粉尘螨,提取总rna,采用rt-pcr方法有效地扩增出derfⅰ片段,产物连接入t载体(pmd18)。经扩增后,用ndeⅰ和xhoⅰ双酶切后将目的片段连接到pet24a表达载体上,得到重组质粒pet24a-derfⅰ,工程菌经iptg诱导培养,高效表达出derfⅰ蛋白,该蛋白主要以包涵体形式存在。表达产物经亲和层析纯化,用westernblot及elisa方法检测免疫学活性,结果表明目的蛋白具有良好的免疫原性。
粉尘螨6类变应原(Derf6)的克隆表达、纯化及免疫学特性鉴定
作者: 朱永烽, 刘志刚, 高波 主题: 粉尘螨, Derf6, 基因表达, 纯化, 蛋白质印迹 年份: 2006
摘要: 目的构建粉尘螨6类变应原(dermatophagoides farinae,derf6)基因的高效原核表达载体,并进行表达、纯化及生物学功能分析。方法根据derf6基因已知序列,设计1对引物,通过对纯培养的粉尘螨提取总rna,采用rt-pcr方法扩增出derf6基因片段,pcr产物克隆入pmd18-t载体,转化大肠埃希菌(e.colitop10),经pcr和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pmd18-t-derf6和空质粒pet-24a同时用限制性内切酶ecorⅰ和xhoⅰ双酶切,经纯化后连接并转化至e.colitop10。构建的重组质粒pet24a-derf6经pcr、酶切和测序鉴定后,再转化至e.colibl21(de3),异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)和蛋白质印迹法(westernblotting)鉴定其表达效果,用ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pet24a-derf6表达产生的组氨酸重组蛋白。结果构建了重组质粒pmd18-t-derf6和pet24a-derf6。sds-page结果表明derf6基因在e.colibl21(de3)中获得良好的表达,所得重组蛋白相对分子质量(mr)为31000,与理论值一致,经亲和层析纯化后,sds-page结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行westernblotting,结果表明具有良好的ige结合活性。结论克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者ige结合活性的derf6。
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