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小麦品种“中国春”主要过敏原CM16基因的克隆及序列分析
作者: 邬玉兰, 刘志刚, 余汉谋, 伍文琪 主题: 小麦, 中国春, 过敏原, CM16, 基因克隆 年份: 2009
摘要: 为了给小麦主要过敏原cm16蛋白的重组表达和免疫活性鉴定等研究奠定基础,通过生物信息学方法设计并合成简并性引物,利用rt-pcr技术对小麦主要过敏原cm16基因进行克隆,并进行序列分析。结果表明,克隆获得了小麦主要过敏原cm16基因。基因开放阅读框为432个碱基(包括终止密码子),编码143个氨基酸。该序列编码的蛋白相对分子质量约为15 782,等电点为5.17。序列同源性分析发现其与国外报道的已知小麦cm16基因具有很高的同源性(同源性为99%),因此认为其系小麦过敏原基因,在genbank数据库中的登录号为eu883599。
鸡蛋主要过敏原Gal d 3基因的克隆、表达、纯化及免疫学鉴定
作者: 吴序栎, 杨志华, 刘志刚, 吴海强 主题: 鸡蛋, 过敏原, 基因克隆, 表达, Gald3 年份: 2009
摘要: 目的:克隆表达鸡蛋主要过敏原gal d 3基因并检验其免疫活性。方法:提取鸡蛋的总rna,采用rt- pcr方法扩增出目的基因片段,将其克隆入t载体中进行测序和分析。设计带有酶切位点的特异性引物,采用rt- pcr获得整个短的开放阅读框并将目的基因克隆到大肠杆菌表达载体pet-28a中进行诱导表达。通过ni~(2+)亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用免疫印迹(western blotting)方法检测其ige结合活性。结果:克隆获得了鸡蛋主要过敏原gal d 3。基因开放阅读框为2118个碱基(包括终止密码子),编码705个氨基酸。该序列编码的蛋白等电点为6.5,相对分子质量约为76000。表达产物经亲和层析纯化,用western blotting方法检测免疫学活性,目的蛋白具有良好的免疫原性。结论:成功地克隆和表达了鸡蛋主要变应原gal d 3基因,该蛋白具有良好的免疫原性。
红星梭子蟹变应原原肌球蛋白基因的克隆、表达及其免疫学鉴定
作者: 吴凯威, 刘志刚 主题: 红红星梭子蟹, 变应原, 原肌球蛋白, 基因克隆, 表达, MALDI-TOF-MS质谱 年份: 2009
摘要: 克隆、表达红星梭子蟹蟹肉中变应原原肌球蛋白(tropomyosin),并对其免疫学特性进行鉴定。rt-pcr克隆红星梭子蟹(portunus sanguinolentus)蟹肉中变应原原肌球蛋白的全长基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增蟹tropomyosin的完整开放阅读框,与pet-28a载体连接并转化大肠杆菌escherichia.colibl21(de3),诱导表达后,ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,western-blot检测其免疫学活性,胰酶消化后进行maldi-tof-ms质谱分析鉴定。克隆所得蟹tropomyosin基因包括一个编码285个氨基酸的开放阅读框。序列分析结果显示所克隆得到的基因与已知虾、螨、蟑螂等的tropomyosin变应原基因有较高的同源性(>80%)。根据变应原的命名规则,将其命名为pors1,并提交genbank数据库,登录号为ef143836。重组蟹tropomyosin在大肠杆菌中能高效的表达,表达产物经ni2+亲和层析柱纯化后进行western-blot检测,结果显示该重组蛋白具有良好的免疫学活性,maldi-tof-ms质谱分析进一步证实了该重组变应原的正确性。本研究成功克隆和表达了红星梭子蟹变应原tropomyosin,为蟹过敏性疾病的诊断和治疗奠定了基础。
平榛主要过敏原Cor h 1的克隆表达、纯化及免疫学鉴定
作者: 莫绪成, 吴序栎, 刘志刚 主题: 平榛, Cor h1, 基因克隆, 表达 年份: 2009
摘要: 目的克隆、表达榛(平榛)主要变应原基因cor h1,检测其免疫学活性。方法提取平榛的总rna,设计带有酶切位点的特异性引物,采用rt-pcr方法扩增目的基因,将其克隆入t载体中进行测序和分析。采用rt-pcr获得整个短的开放阅读框并将目的基因克隆到大肠杆菌表达载体pet28a中进行表达。通过ni2+亲和层析,对重组蛋白进行纯化,采用免疫印迹(western-blot)方法检测其ige结合活性。结果克隆获得了平榛的主要过敏原cor h1的基因,该基因被genbank收录,登陆号为eu195058。基因开放阅读框为486个碱基(包括终止密码子),编码161个氨基酸。该序列编码的蛋白等电点为6.16,相对分子质量约为17600。结论成功地克隆和表达了平榛主要变应原cor h1,蛋白具有良好的免疫原性。
棕点石斑鱼Piscidin样肽基因的克隆及其成熟肽的原核表达
作者: 陈大玮, 邓利, 何凡, 邱聪龄, 马一见, 刘志刚 主题: 抗菌肽, Piscidin, 基因克隆, 原核表达, 棕点石斑鱼 年份: 2011
摘要: 以简并引物通过rt-pcr从重要经济海水鱼类棕点石斑鱼epinephelus fuscoguttatus白细胞中扩增出一条388bp具有完整编码框的cdna序列。blast分析初步显示,该序列属于鱼类抗菌肽piscidin家族的一员,将其命名为棕点石斑鱼piscidin样肽(gu592793),推导氨基酸序列具有界定鱼类piscidin的以下共同特征:(1)预测的信号肽序列与其他piscidin的同源性较高,在60%~95%之间;(2)推测的成熟肽n端6个氨基酸残基富含phe、ile及his;(3)成熟肽第8个和第13个氨基酸位点均为gly。nj进化树分析表明,该cdna推导的氨基酸序列与赤点石斑鱼epinephelusakaarapiscidin-like peptide(ace78290)、斜带石斑鱼epinephelus coioidespiscidin-like peptide(ace78291)以高达81%的支持率聚为一支。也表明本研究成功克隆到棕点石斑鱼首条piscidincdna序列。推测的成熟肽为两亲性阳离子肽,等电点12.48,schiffer-edmunson预测其二级结构呈α螺旋构型。将推测的成熟肽序列亚克隆至pet-32a构建融合表达载体pet-32a-pis(ef),并在大肠杆菌e.coliorigami(de3)中成功表达出融合蛋白,以1mmol/ml iptg于30℃进行诱导表达,4 h可获得大量表达,目的蛋白以包涵体形式存在。
芝麻主要过敏原油质蛋白的基因克隆和原核表达
作者: 何凡, 邬玉兰, 刘志刚 主题: 芝麻, 油质蛋白, 过敏原, 基因克隆, 原核表达 年份: 2010
摘要: 为克隆黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白oleosins的基因并在原核细胞中对其进行表达,本研究分别提取黑、白芝麻的总rna,逆转录合成cdna,根据序列设计简并引物,扩增芝麻主要过敏原油质蛋白oleosins基因的完整开放阅读框,并与pet-28a载体连接,测序鉴定后转化大肠杆菌e.colibl21(de3)及用iptg诱导表达。结果表明克隆获得黑、白芝麻主要过敏原油质蛋白oleosins的全长基因约为438bp的开放阅读框(包括终止密码子),编码145个氨基酸。所编码的蛋白相对分子质量约为15.5kda,为小分子量蛋白,等电点为5.18,与理论值相符。序列同源性分析发现其与数据库中已知的黑、白芝麻油质蛋白oleosins基因同源性很高(genbank黑、白芝麻油质蛋白基因登录号分别为eu999158和eu999159),并在de3中高效表达。
大豆主要过敏原Gly m Bd 30K的抗原表位区基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定
作者: 林苏霞, 王晓梅, 刘志刚, 曾梦雅, 吴研, 陈家杰 主题: 大豆主要过敏原, Gly m Bd 30k, 抗原表位区, 基因克隆 年份: 2010
摘要: 根据文献并结合生物信息学方法选取大豆主要过敏原gly m bd 30k的抗原表位区,采用pcr方法扩增出该抗原表位区基因片段,并通过酶切连接分别构建单体的pet表达载体(pet-sgly)和二聚体的pet表达载体(pet-dgly),重组质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)plyss,经iptg诱导后进行sds-page分析;同时用ni2+离子亲和层析柱纯化表达的sgly和dgly抗原表位蛋白,用western-blotting和elisa检测重组蛋白的免疫原性。结果表明:表达的单体sgly蛋白以可溶性表达为主,而其二聚体dgly蛋白以包涵体形式存在,纯化的sgly和dgly蛋白都具有较好的免疫原性,重组蛋白sgly的抗原性更佳。成功构建的大豆主要过敏原gly m bd 30k蛋白的抗原表位区单体sgly蛋白及其二聚体dgly蛋白的工程菌,为研制大豆主要过敏原的单克隆抗体以制备用于大豆主要过敏原检测的试剂奠定了基础。
家蚕蚕蛹过敏原几丁质酶基因的克隆和原核表达载体的构建
作者: 刘硕, 黄钟, 罗新萍, 刘志刚, 陈思 主题: 家蚕, 过敏原, 几丁质酶, 基因克隆, 原核表达载体 年份: 2010
摘要: 目的克隆、表达家蚕蚕蛹过敏原几丁质酶基因,并构建其原核表达载体。方法提取家蚕的总rna,rt-pcr克隆家蚕过敏原几丁质酶的全长基因,设计简并引物,扩增家蚕几丁质酶基因的完整开放阅读框,与pet-28a载体连接,构建原核表达载体。结果成功克隆家蚕主要变应原几丁质酶基因并构建其原核表达载体。该基因含有长度为1668bp的开放阅读框,编码555个氨基酸。该蛋白质的相对分子质量为61500,电点为5.78,编码序列与数据库中已知的家蚕几丁质酶基因的同源性为99%。结论成功克隆家蚕蚕蛹主要过敏原几丁质酶基因并构建了原核表达载体,为家蚕蚕蛹过敏原几丁质酶的重组表达和免疫活性鉴定等奠定了基础。
牛奶主要过敏原α_(s1)-酪蛋白全长与片段区基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定
作者: 曹燕娟, 胡东生, 刘志刚, 陈思, 罗新萍, 黄钟 主题: 牛奶过敏原, αs1-酪蛋白, 基因克隆, 表达 年份: 2010
摘要: 目的:克隆并表达牛奶中主要过敏原αs1-酪蛋白的全长及n端、c端两个片段区基因,用于筛选与制备牛奶主要过敏原的单克隆抗体。方法:利用rt-pcr技术克隆αs1-酪蛋白基因,测序后将目的片段克隆入原核表达质粒pet载体,转化至大肠杆菌(e.coli)bl21(de3)。经iptg诱导表达,获得重组αs1-酪蛋白。用ni2+亲和层析柱纯化,用western blot和elisa检测重组蛋白与牛奶过敏患者血清ige的结合活性。结果:克隆获得αs1-酪蛋白全长的开放阅读框基因为645bp(含终止密码子),编码214个氨基酸。n、c端片段区基因(含终止密码子)分别为285、294bp,编码94、97个氨基酸。三种重组蛋白均能以可溶性表达形式纯化,经western blot和elisa检测都具有较好的免疫原性,而αs1-酪蛋白全长的免疫原性更强。结论:成功地克隆和表达了αs1-酪蛋白全长及n、c端两个片段区基因,为研制牛奶主要过敏原的单克隆抗体,制备牛奶主要过敏原的检测试剂奠定了基础。
牛乳主要过敏原α-乳白蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建
作者: 闫浩, 邬玉兰, 夏立新, 刘志刚 主题: 牛乳, α-乳白蛋白, 基因克隆, 原核表达 年份: 2010
摘要: 采用rt-pcr技术克隆牛乳主要过敏原α-乳白蛋白的全长基因,并根据序列设计带有酶切位点的特异性引物对所得cdna的开放阅读框进行扩增,将所得基因片段克隆到pet-28a载体.结果克隆了牛乳主要过敏原α-乳白蛋白的完整基因,所克隆的基因开放阅读框全长为429 bp,编码142个氨基酸,该蛋白相对分子质量约为16 265,等电点为6.10,与理论值相符.通过与genbank中已有序列比对分析,同源性高达100%.实现构建该基因的pet-28a原核表达载体,为牛乳主要过敏原α-乳白蛋白基因的相关研究奠定了基础.
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