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鸡蛋过敏原分离、鉴定与纯化
作者: 吴序栎, 杨志华, 刘志刚, 吉坤美 主题: 鸡蛋, 过敏原, 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE), 免疫印迹(Western-blotting), 离子交换层析 年份: 2009
摘要: 目的对鸡蛋中主要过敏原进行分离、鉴定与纯化。方法分别提取鸡蛋的蛋清与蛋黄的蛋白,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离鸡蛋的蛋白质组份,采用免疫印迹(western-blotting,wb)方法鉴定过敏原,通过离子交换层析对鸡蛋主要过敏原进行初步纯化。结果wb检测显示,蛋黄与鸡蛋过敏患者的阳性混合血清没有反应;蛋清中有4条蛋白带起反应,分子量分别为83,71,38,13 kd,尤以13 kd的蛋白质最为明显,离子交换层析可初步纯化出13 kd的过敏原蛋白。结论鸡蛋的主要过敏原为13 kd的蛋白质,为临床诊断和治疗鸡蛋过敏性疾病提供标准化的过敏原提供了基础依据。
口虾蛄原肌球蛋白基因表达及变应原性鉴定
作者: 詹政科, 刘志刚, 吉坤美 主题: 口虾蛄, 变应原, 原肌球蛋白, 克隆表达 年份: 2009
摘要: 目的克隆口虾蛄原肌球蛋白(tropomyosin)基因并表达纯化出重组蛋白,研究其变应原性。方法提取口虾蛄总rna,设计特异引物,通过反转录聚合酶链反应克隆出目的基因片段,测序后将该片段克隆到原核表达载体pet-28a上,转化到e.colibl21(de3)后,经异丙基-b-d-硫代乳糖苷(iptg)诱导表达,用ni2+亲和层析柱对重组变应原进行纯化。采用免疫印迹(western-blot)检测其与对虾过敏的患者血清ige结合活性。结果经序列测定,该基因含有长度为855bp的开放阅读框,编码284个氨基酸(genbank登录号为ef584510)。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测该重组变应原在大肠埃希菌中高效表达36kda的目的蛋白,且重组变应原具有良好的ige结合活性。结论本研究成功获得了具有变应原活性的重组口虾蛄原肌球蛋白。
双抗体夹心ELISA法测定食物中牛奶过敏原蛋白成分
作者: 詹政科, 刘萍, 吉坤美, 李佳娜, 仇什, 刘志刚 主题: ELISA, 多克隆抗体, 牛奶过敏原, 食物过敏 年份: 2009
摘要: 建立双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(elisa)测定食物中牛奶过敏原成分。通过提取牛奶过敏原蛋白,免疫小鼠制备抗牛奶过敏原的多抗,免疫印迹法鉴定多抗与牛奶过敏原蛋白的反应,并建立双多抗夹心elisa法。结果表明,该法检测牛奶过敏原蛋白的最低检出限为25μg/l,标准曲线在25~1000μg/l范围内线性良好;同时对市场上食物标签标注含有牛奶、未含牛奶成分以及标注不详共12种食品进行检测,结果10种食品检测结果与食物标签标注内容相符,而2种标示不详的食品检测结果一个呈现阳性,一个呈现阴性。这说明本方法对于未标注牛奶过敏原成份的食品检测具有一定的实际应用价值。
双抗体夹心ELISA法测定食物中花生过敏原蛋白成分
作者: 吉坤美, 陈家杰, 汤慕瑾, 郑丽, 刘志刚 主题: ELISA, 多克隆抗体, 花生过敏原, 食物过敏 年份: 2009
摘要: 通过建立双抗体夹心elisa法测定食物中花生过敏原蛋白成分,为进出口食品花生过敏原成分检测和由花生导致的食物过敏性疾病的预防提供技术基础。提取花生总蛋白,免疫小鼠制备抗花生总蛋白的多克隆抗体,用该抗体包被酶标板,并用生物素标记该多抗,从而建立双多抗体夹心elisa法;自制花生总蛋白标准品并检测该方法的灵敏度,同时检测15种食品中是否含有花生蛋白成分。成功地研制出双抗体夹心elisa法检测食品中花生过敏原蛋白成分,具有特异性,其最低检出限为8ng/ml,标准曲线在8ng/ml~125ng/ml范围内线性良好;13种食品检测结果与食物过敏原标签标注内容相符,而2种标示不详的食品检测结果均呈现阳性。
双抗体夹心ELISA法测定食物中大豆过敏原蛋白成分
作者: 陈家杰, 朱海, 叶卫翔, 吉坤美, 刘志刚 主题: ELISA, 多克隆抗体, 大豆过敏原, 食物过敏 年份: 2009
摘要: 通过建立双抗体夹心elisa法测定食物中大豆过敏原蛋白成分,为进出口食品中大豆过敏原成分检测和食物过敏性疾病的预防提供技术基础。提取大豆总蛋白,免疫小鼠制备抗大豆总蛋白的多克隆抗体,用该抗体做包被抗体,并用生物素标记该多抗作为捕捉抗体,从而建立双多抗体夹心elisa法;检测该方法的灵敏度,同时检测10种食品中是否含有大豆过敏原蛋白成分。sds-page电泳结果显示大豆过敏原总蛋白在120、60、35、30、28、18ku处条带明显;免疫印迹显示,这些条带与制备的高效价抗大豆蛋白的多抗具有明显的阳性反应。检测食品中大豆过敏原蛋白成分双抗体夹心elisa法最低检出限为~100ng/ml,标准曲线在100ng/ml~12.8μg/ml范围内线性良好;10种进口食品检测结果与食物过敏原标签标注内容相符。
胶体金免疫层析法检测食品中花生过敏原蛋白成分
作者: 吉坤美, 陈家杰, 詹群珊, 李佳娜, 刘志刚 主题: 花生过敏原, 胶体金, 免疫层析法, 食物过敏 年份: 2009
摘要: 建立一种简易快速胶体金免疫层析法(gica)用于检测食品中花生蛋白成分。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒、标记抗花生蛋白成分的抗体,制成免疫层析测试条。食品中花生蛋白成分与测试条上金标记抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动,与膜上的固相抗体结合形成肉眼可见的红色线条。自制花生抗原标准品并检测该方法的灵敏度,同时检测19种食品中是否含有花生蛋白成分。结果表明:gica测试条与花生蛋白抗原呈特异性反应,检测自制的花生抗原标准品的灵敏度可达50ng/ml,用gica试条检测了19种食品中,其中13种食品标签上标注含有花生过敏原成分的食品检测结果均呈阳性,4种食品标签上标注不含花生过敏原成分的食品检测结果均呈阴性,而2种食品标签上没有标注过敏原成分的食品检测呈阳性。
实时定量PCR技术检测食品中花生过敏原Ara h1基因成分
作者: 吉坤美, 陈家杰, 王海燕, 刘晓宇, 刘志刚 主题: 实时定量PCR, TaqMan探针, 花生主要过敏原, Arah1 年份: 2010
摘要: 采用taqman探针pcr技术,建立食品中花生主要过敏原基因ara h1的检测方法。根据genbank提供的arah1基因(序列号af432231)中一段dna序列设计特异性引物与taqman探针,扩增该目的基因,建立拷贝数-ct标准曲线,可通过标准曲线方程计算食品中含有花生主要过敏原ara h1基因拷贝数(copies),并用于检测8种食品中是否含有残留的该过敏原基因。此标准曲线在1.5×103copies~1.5×107copies范围内线性关系良好,r2值为0.975 9;8种样品检测结果与食物过敏原标注内容相一致。
两种PCR方法检测食品中花生过敏原Arah1成分
作者: 陈家杰, 王海燕, 梁秋妮, 吉坤美, 刘志刚 主题: 套式PCR, 荧光实时定量PCR, 花生主要过敏原, Arah1 年份: 2011
摘要: 采用套式pcr和荧光实时定量pcr两种方法检测食品中花生主要过敏原ara h1基因成分,从而推断食品中是否含有花生过敏原成分。根据genbank提供的花生主要过敏原基因ara h1 dna序列(登录号为af432231)的中一段序列分别设计2对内外特异性引物,扩增目的基因片段来建立套式pcr方法;再用上述内引物扩增目的片段,建立sybrgreenⅰ荧光实时定量pcr方法,绘出拷贝数-ct标准曲线;并通过这2种pcr方法检测8种食品中含有花生主要过敏原ara h1基因成分。套式pcr方法具有较高的特异性和灵敏度,sybr greenⅰ荧光实时定量pcr方法的标准曲线在3×102至3×108 copies范围内线性关系良好,r2值为0.993 5,检测低限设定为3×103 copies。2种方法检测8种食品样品,结果均与食物过敏原标注内容相符。本研究建立的2种方法具有快速、灵敏等优点,可用于食品中花生主要过敏原基因ara h1成分的检测。
抗粉尘螨主要变应原Der f1单克隆抗体的制备与鉴定
作者: 顾耀亮, 李佳娜, 陈家杰, 吉坤美, 刘志刚 主题: Der f1, 粉尘螨, 主要变应原, 单克隆抗体, 特性鉴定 年份: 2009
摘要: 目的制备和鉴定鼠抗粉尘螨主要变应原der f1的单克隆抗体(monoclonal antibody,mcab)。方法利用重组der f1蛋白为免疫原,免疫balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤ns-1细胞融合。通过间接elisa法筛选特异性分泌的杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白a亲和层析法进行抗体纯化。采用ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的ig亚型;通过间接elisa、western blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。结果获得6株可稳定分泌鼠抗粉尘螨主要变应原der f1的单克隆抗体,其ig亚型均为igg1,且6株单抗均具有良好的效价。elisa和western-blotting分析表明,该6株单抗均能识别重组der f1蛋白和天然的粉尘螨提取物。其中,除了484不识别屋尘螨提取物,其他均能识别。结论成功制备了6株鼠抗粉尘螨主要变应原der f1的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原der f1检测及纯化方法奠定了基础。
标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中主要变应原Der f 2含量测定
作者: 吉坤美, 刘晓宇, 唐艳, 詹政科, 刘志刚 主题: 尘螨过敏原, Der f 2, 单克隆抗体, 夹心ELISA 年份: 2010
摘要: 目的研制粉尘螨ⅱ组变应原der f 2单克隆抗体(monoclonal antibody,mcab),并建立双单抗夹心elisa检测方法 ,测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中der f 2的含量。方法应用基因工程方法获得粉尘螨变应原der f2重组蛋白并通过亲和层析纯化,再免疫小鼠,利用间接elisa筛选获得mcab杂交瘤细胞株并纯化、鉴定抗体的特异性;用一株单抗包被酶标板,同时用生物素标记另一株单抗,从而建立双单抗体夹心elisa法;并用此法测定粉尘螨变应原脱敏疫苗中der f2的含量。结果成功地获得了一株单抗3b12与屋尘螨抗原具有交叉反应,另外一株单抗3g7与屋尘螨抗原没有交叉反应,并建立了双单抗夹心elisa方法测定der f2的含量,其方法的检测限为0.5ng/ml,并在6.25ng/ml-300ng/ml范围内线性良好;标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中der f2的含量为100ng/10000bau。结论成功制备了高效价抗der f 2单抗,并建立了双抗体夹心elisa检测方法。该方法具有很高的灵敏度,可以测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中主要变应原der f 2含量,为临床应用奠定基础。
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